CÔNG TY TNHH THIẾT BỊ KHOA HỌC KỸ THUẬT AN DƯƠNG
info@adgroup.vn
Chemiluminescence là phương pháp phổ biến nhất để phát hiện trong kỹ thuật Western blotting và mang lại
độ nhạy cao; tuy nhiên, nhiều câu hỏi khoa học và thiết kế thực nghiệm đòi hỏi thông tin bổ sung mà fluorescence
Western blotting mang lại. Phát hiện fluorescence cung cấp sự định lượng chính xác và hình ảnh của các
protein có kích thước tương tự trong cùng một mẫu. Nếu bạn muốn chuyển từ quy trình Western blot sử
dụng chemiluminescence sang quy trình Western blot fluorescence đa tín hiệu, bạn cần xem xét và tối ưu hóa
kỹ thuật hiện tại của mình để có kết quả tốt nhất. Để đảm bảo rằng sự chuyển đổi này được thực hiện một cách
hiệu quả, hãy xem xét lại quy trình Western blot chemiluminescent tiêu chuẩn này trước khi bắt đầu tiền tối ưu
hóa quy trình fluorescence.
Trong bài đăng này, chúng tôi chia sẻ mười mẹo hàng đầu để giúp bạn chuyển từ chemiluminescence sang
multiplex fluorescence Western blot một cách thành công.
Với quy trình fluorescent, chỉ cần một lượng nhỏ marker. Nhiều loại marker cần được pha loãng 1:10 trong dung dịch nạp mẫu. Điều này sẽ dẫn đến marker rất nhạt trên tấm màng, có thể gây nghi ngờ về hiệu suất sau khi chuyển màng. Điều này là đúng và cần thiết để có hình ảnh Western fluorescent chất lượng cao.
Phần dye protein có thể làm chất nền cho các tín hiệu huỳnh quang. Do đó, hãy chắc chắn để hoặc cho phép phần dye protein chạy ra khỏi gel trong quá trình điện di, hoặc cắt phần dye ra khỏi gel trước khi chuyển lên màng.
Các phương pháp chuyển màng cũng có thể ảnh hưởng đến kết quả của multiplex fluorescent blot. Việc sử dụng phương pháp chuyển màng ướt là lựa chọn lý tưởng vì nó cho phép tối ưu hóa và phân tích định lượng cao do tính linh hoạt cao của chúng. Để đảm bảo chuyển toàn bộ protein, thời gian, nhiệt độ, điện áp và đệm chuyển màng có thể được biến đổi dựa trên protein mục tiêu. Với phương pháp chuyển bán ướt, thời gian chuyển không thể được gia hạn để tăng khả năng chuyển protein hơn và có khả năng khô nhanh do lượng dung dịch sử dụng có hạn. Điều này có nghĩa là với phương pháp chuyển màng bán ướt, protein ở 2 phía đầu gel và cuối gel sẽ khó khăn trong quá trình chuyển màng.
Sau khi quá trình chuyển đã hoàn tất, không nên viết bằng mực hoặc bút chì trực tiếp trên màng; chất graphite và mực có thể trộn lẫn và tự phát quang. Sau khi chuyển, không nên tiếp xúc màng với bất kỳ dung cụ nào đã từng tiếp xúc với Coomassie stain. Chỉ sử dụng khay dành riêng cho Western blot sạch sẽ.
Bước Blocking màng trong trong Western blot huỳnh quang có thể là một công việc khó khăn. Ban đầu, việc sử dụng đệm blocking phát quang chuyên dụng, như loại này, giúp quá trình chuyển đổi từ hóa phát quang sang huỳnh quang trở nên đơn giản và thuận tiện hơn nhiều. Chúng tôi đặc biệt khuyến khích sử dụng đệm Blocking Fluorescent Blot của Azure, vì nó ổn định tín hiệu phát quang và đã được chuẩn bị sẵn để sử dụng. Khi bạn đã tối ưu hóa các phần khác trong giao thức của mình, sau đó bạn có thể thử nghiệm sữa gầy và các đệm blocking khác.
Thuốc nhuộm Ponceau có thể làm tăng độ phát quang nền. Vì mục tiêu cuối cùng của chúng ta là một bức ảnh Western blot phát quang đẹp, tránh sử dụng bất kỳ chất phản ứng nào vì chúng có thể làm tăng độ phát quang nền.
Trước khi chuyển đổi sang quy trình phát quang đa kênh, đánh giá xem kết quả Western hiện tại như thế nào. Bạn định kết hợp những protein nào cùng nhau? Các kháng thể hiện tại bạn đang sử dụng cho các protein khác nhau có tạo ra dải sạch, rõ ràng và nền thấp không? Nếu không, việc tối ưu hóa kháng thể chủ yếu là cần thiết.
Kháng thể đánh dấu trực tiếp cho phép sử dụng các kháng thể từ cùng một loài hoặc cùng loại và giảm khả năng tác động chéo
Đọc thêm: Antibody Labeling in the Lab
Sự khác biệt về chất lượng hình ảnh chỉ do lựa chọn đệm washing có thể là đột ngột. Sử dụng đệm washing cụ thể cho Western blot huỳnh quang là lựa chọn lý tưởng ở đây. Hãy xem xét đệm fluorescent washing này. Nó được tối ưu hóa hoàn hảo để sử dụng với các kháng thể bậc 2 phát quang.
Hãy kiểm tra sự khác biệt mà việc sử dụng đệm washing huỳnh quang có thể tạo ra bằng cách chuẩn bị hai dải gel một cách song song bằng cách sử dụng các loại đệm khác nhau. Chúng tôi cũng hiển thị điều này trong các hình ảnh so sánh bên dưới.
Nếu bạn không có sẵn bộ đệm tạo sẵn này thì sử dụng TBST với 0,1% Tween20 là một giải pháp thay thế có thể chấp nhận được.
Thông thường, các protein yêu cầu thời gian để tạo tín hiệu với film dưới 3 phút để có thể được phát hiện tương đối tốt với fluorescence. Nếu bạn đang sử dụng một chất phát quang ECL mạnh với thời gian chiếu lớn hơn 5 phút để phát hiện protein quan tâm, bạn có thể cần tối ưu hóa phương pháp phát hiện protein fluorescence để có kết quả tối ưu.
Tối ưu hóa protein của bạn dễ dàng thực hiện với các bộ Western blot fluorescent, bạn có thể tham khảo bộ kit dưới đây. Đó là một bộ đầy đủ với mọi thứ bạn cần để thực hiện mười lần Western blot fluorescent hai màu .
Khi đã thêm các kháng thể bậc 2 fluorescent vào màng, bảo vệ màng khỏi ánh sáng là rất quan trọng. Trong quá trình rửa và chụp hình, giữ tiếp xúc với ánh sáng tối thiểu để đảm bảo tín hiệu fluorescent mạnh nhất.
Các kháng thể bậc 2 AzureSpectra được đánh dấu bằng fluorophores phát ra ánh sáng ở bước sóng khả kiến và gần hồng ngoại. Các kháng thể thứ cấp AzureSpectra 490, 550, 650, 700 và 800 mang lại độ nhạy và hiệu suất vượt trội cho các ứng dụng immunoblotting khi kết hợp với Hệ thống chụp ảnh Western Blot Azure. Do độ nền tự động thấp ở vùng gần hồng ngoại, các kháng thể thứ cấp AzureSpectra 700 và 800 có thể tạo ra tỷ lệ tín hiệu/nền cao hơn.
Một quy tắc tốt là phát hiện các protein phổ biến nhất bằng kênh IR700. Bạn có thể sử dụng kênh IR800 để phát hiện các protein ít phổ biến hơn. Nếu cả hai protein đang được đánh giá đều yêu cầu thời gian phơi dưới một phút trên film, bạn có thể sử dụng bất kỳ kênh nào để phát hiện cả hai protein.
Azure 600 là một thiết bị hình ảnh cung cấp công nghệ laser với hai kênh phát hiện IR, giúp bạn phát hiện hơn một protein trong một phép đo. Nó cung cấp khả năng phát hiện hoá học chính xác và nhanh chóng, cũng như độ nhạy, phạm vi động và tuyến tính cần thiết cho phân tích định lượng Western Blot .
Fluorescent Western blots được biểu diễn bằng một thiết bị chụp ảnh, như Azure Sapphire FL. Việc sử dụng một thiết bị chụp ảnh với nhiều kênh Fluorescent và hóa phát quang giúp loại bỏ nhu cầu tẩy và làm mới các màng. Các hệ thống chụp ảnh mới có các cảm biến phức tạp với khả năng hiển thị một phạm vi động rộng hơn so với phim và do đó tránh được vấn đề bão hòa tín hiệu.
Sapphire FL có thể phát hiện đến bốn protein trên cùng một màng blot và các dải trùng lấp có thể được đo lường. Điều này giúp bạn tiết kiệm chi phí, dung dịch, và giảm thời gian làm thí nghiệm.
Bằng cách tuân thủ những thực hành tốt này và ghi nhớ mười gợi ý multiplex fluorescent này, chúng tôi hy vọng bạn sẽ thấy rằng việc chuyển đổi quy trình Western Blot chemiluminescent hiện tại của bạn thành quy trình Western Blot fluorescent multiplex có thể đơn giản và thành công. Nếu bạn gặp khó khăn hoặc có câu hỏi, vui lòng liên hệ với đội ngũ của chúng tôi để được hỗ trợ thêm.
Các bài viết khác về multiplex Western blotting: